まずTAK1活性を生きた細胞内でリアルタイムに検出するため、蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) に基づく新規バイオセンサーを開発しました。FRET/CFP比が大きいほどTAK1活性が高く、小さいほどTAK1活性が低いことを示しており、ヒートマップ表示ではそれぞれ赤色、青色で表せます。本バイオセンサーを培養細胞に発現させて様々な刺激に対する応答性を確認しました。次にこのバイオセンサーのTAK1特異性を調べました。TAK1阻害剤、shRNAを用いたTAK1ノックダウンでは本バイオセンサーのFRET/CFP比の上昇が抑制されることを確認しました(図１)。私たちは本バイオセンサーをEevee-TAK1と命名しました。

図１：Eevee-TAK1の応答性、特異性の確認。(A) HeLa細胞にEevee-TAK1を発現させ、5μg/mL anisomycin刺激を加えた後、60分間にわたって細胞内でのFRET/CFP比の変化を観察した。(B) HeLa細胞にEevee-TAK1を発現させ、様々な刺激に対する応答性を確認した。(C) HeLa細胞にEevee-TAK1を発現させ、様々なリン酸化酵素の阻害剤を加えることでanisomycin刺激後のFRET/CFP比上昇が抑制されるかどうか確認した。(D) 3LL細胞にEevee-TAK1を発現させ、さらにshRNAを用いてTAK1をノックダウンして、IL-1β刺激後のFRET/CFP比上昇が抑制されるかどうか確認した。

次に、Eevee-TAK1をマウスを用いたin vivo imagingに応用し、マウス皮下に移植した腫瘍内でのTAK1活性を観察しました。ガラスと磁石で作成したimaging windowを使って、マウス皮下に移植した腫瘍を二光子励起顕微鏡で数日にわたって観察できる実験系を確立しました。Imaging window下に3LL細胞を移植したところ、腫瘍の中心部から辺縁部にかけてTAK1活性が高くなっていることが分かりました（図2）。

図２：(A) Imaging windowと移植した腫瘍のイメージ図。(B) マウスの固定方法。(C) 二光子励起顕微鏡を用いて5日間にわたってimaging window下の腫瘍を観察した。

さらに、先行研究においてPolyI:C投与により腫瘍が小さくなることが知られていましたが、その時に腫瘍塊内のTAK1活性がどのように変化するかを調べました。すると、腫瘍塊内でTAK1活性が一様に上昇する様子を観察することに成功しました（図3）。

図３：(A) Imaging window下にpolyI:Cを投与し、腫瘍内におけるTAK1活性の変化を観察した。(B) 横軸に(A)中の*を原点とした直線上の距離、縦軸に直線上のFRET/CFP比をプロットした。