FLIMのやり方

目次

• Mai-tai DeepSeeの立ち上げ方
• FV1000での観察
• FLIM起動
• FLIM観察
• 終了
• FLIM解析
• MetaMorphでの解析
• トラブルシューティング

仕様とメモ

1. Olympus FV1000-MP, IX83
2. Spectra Physics　Mai Tai DeepSee
3. Becker & Hickl GmbH　SPC-150/DCC-100/SPC Image

Mai-Tai DeepSeeの仕様
1. 80 MHz. つまり、12.5 nsに１回発振する。蛍光寿命はこの時間内に測定し終える必要がある。蛍光タンパク質は3 nsくらい。有機蛍光色素は1ns＞。
2. Pulse 幅　＝　70 fs。蛍光寿命と比較して十分短い。
3. Defaultでは、12 ns解析している。Matrixは256である（T1, T2の時間）。

Mai-tai DeepSeeの立ち上げ方

1. DELL notebook PCを起動する。
2. 「com port1」を選択 「scan」「setup」は使用しない。
3. 「shutter」が閉じていることを確認。
4. 「ON/OFF」ボタンを「EMISSION」が点灯するまで長押ししてレーザーを発振させる。5分くらいかかる。
5. 「shutter」を開く。長押し。

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FV1000での観察

1. 集合電源のMain Switch ON。
2. HgランプON。
3. PC　ON
4. FV10-ASW　起動
5. 顕微鏡右側面のキューブチェンジャーのシャッターを開ける（普段は開いているはずだが。手動）
6. 透過光で観察、ついで蛍光観察

7. 蛍光キューブはIX83のパネルからNIBAを選択。青い光。赤は右のボタン。
8. 画像の二光子観察：感度の設定。これが大事

9. 画像の二光子観察：タイムラプスやるときの設定(FLIMでは使わない)。

10. 画像の二光子観察：512*512で観察のこと。

11. Zoomをかけてみたい領域だけScanするようにする。

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FLIMでの観察の要注意事項

重要な注意点： 検出器（PMTとAPDのハイブリッド）は強い光（蛍光灯レベルでもだめ）が当たると壊れる。 検出器に強い光を入れないようにくれぐれも注意のこと。電源が入っていないときでも光を当ててはいけない。

1. シャッターは2か所：顕微鏡右横のレバー（手動）とDCC-100のシャッター（Enableで開く）
2. レバーで光路を検出器に変更するときは、室内灯は消すこと。
3. DCC-100（検出器）をEnableする前に、カーテンを閉めること。
4. 実験中に顕微鏡の接眼レンズで目視するときが特に危ない。必ず右横のレバーが押し込まれているか確認のこと。

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FLIM起動：電源を入れる順番は重要

• Simple_Tau (extension box)のMain Switch ON。写真の前面にスイッチ。後面に主電源スイッチがある。主電源スイッチはずっといれたままでいい。

• NotePCの電源を入れる。
• SPCM64を起動：　SPC-150とDCC-100の二つのWindowが起動する。DCC-100はSPC-150の後ろにあるので見えないことがある。
• 電源を入れる順番を間違えると、SPCM64がsimulation modeで起動するので注意。

• Predefined setupから、512*512*256を選択。
• SPC-150：　画像を右クリック -> Display Parameters -> Autoscale, OFF; MAX Count, 600; HiColor, Red
• Lifetimeの測定には6000 photonが必要。通常、Binning 1 (9 pixels)をかけるので、600くらいでOK。測定したいところが赤くなったら終了。

• この時点では、SYNCのみ数字が出ている。画像もまだでていない。
• DCC-100のwindowに移って、Enable Outputs（シャッターを開く）




• SYNC以外の数字(/sec)が動き始める。
• SYNC: Laserの周期, 80 MHz -> 12.5 nsおきに発振。
• CFD, constant fraction discriminators: 検出された光子の数
• TAC, Time-to-Amplitude Converter: Amplitudeに転換された電子数
• ADC, Analogue to Digital Converter : デジタル転換された電子数
• 観察中にCFDが減少すればPhotobleachingしているということ。
• 動作確認ができたら、いったん、DCC-100をDisableする。

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FLIM観察


• FV10-ASW：　Scan開始し、観察する細胞を中心に持ってきて、Focusを合わせる。いったんScan停止。
• IX83：　右側面のレバー（図の黄色）を引っ張る（光路切り替え）
• カーテンを閉じる。
• DCC-100：　Enable（シャッターを開く）
• FV10-ASW：　Laser Scan開始。
• SPC-150：　CFD, TAC, ADCが増加するはず。
• SPC-150：　START！
• FV10-ASW：　Laser PowerをCFDが5*10^4 - 5*10^6になるように調整。
• SPC-150：　見るべき細胞が規定値を超えたら（赤くなる）STOP！
• FV10-ASW：　Scan停止
• SPC-150：　Save the FLIM data; Main -> Save 　ZドライブがDOCKなのでここに保存してください。
• このまま解析するか、ほかの細胞の観察を続ける。



SPCの終了

1. SPC-150： Main->Exit
2. Windows 終了。
3. DCC-100の電源を切る。/li>
4. FV10-ASWを終了する。

Mai Tai DeepSEEのShutOFF

1. 「shutter」を閉じる。
2. 「ON/OFF」ボタンを押し、レーザー発振を止める。
3. 「QUIT」を押す
4. Windowsを終了する。

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FLIM解析： SPCImage

• このプログラムの仕事: Lifetimeをモデルに当てはめて計算する。
• 開始：　File（*.sdt） -> Import
• 左画面、生データ；右画面、Calculateした結果がでるところ
• Blue crosshair：は最初に一番Intensityの高いところにでるが動かせる。この点のDecayが下図に出てくる。
• コマンドラインの用語解説
  • Calculate : 指定した領域のDecay matrixを計算し、絵とヒストグラムを右画面にだす。
  • IRF(instrumental response function): 検出器の時間分解能を示す関数。緑のライン。その都度計算もできるし、あらかじめ実験で決めておいてもいい。
  • Mask 領域を任意に指定できる。
• 右下画面の用語解説

• component: 蛍光寿命がいくつあるとしてFitするか。Lifetimeに大きく影響するので解析中は一定にすること。
• Photon count(2つの蛍光寿命の場合）：　N(t) = a₁*e^-t/τ₁ + a₂*e^-t/τ₂ (a₁ + a₂ = 1)
• a₁, ある蛍光寿命をもつ分子の割合；τ₁, 蛍光の時定数
• Shift: IRFと蛍光のずれ（緑線のピーク）
• Scatter: 散乱光および二次高調波の漏れこみ（一番最初のピークにのみ影響する）
• Offset: 室内光などの漏れこみ。
• a₁/a₂: それぞれの蛍光寿命をもつ分子数の比。厳密なFRET効率を示す。
• tm: 平均の蛍光時定数（寿命）、FRETのレベルを示す。


• Decay matrix（右図）

• T1-T2 の間（黒線で出てる）を解析: ここをよい値に設定することが大事。χ²の値を参考にしながら変える。数字は256チャンネルの値。
• Bin, Binning。MetaMorphと違う。0=1 pixel, 1=3x3, 2=5x5, --
• この値は、どれくらいのPhoton count（一番下の数字）が解析に必要かを考えて決める。目安＝蛍光分子1個、100；　二つ、1000；　三つ、10000。 蛍光寿命が既知であればFixできるので、ずっと少なくできる。
• χ²: χ²検定による尤度。 現在のモデルの信頼性を各ピクセルごとに表示している。この値をできるだけ小さくするようにモデルを決める。
• Threshold, 計算をするPixelの最低のPhoton数。計算時間を早くする。普通はautoになってる。替えたければ、Options > Model dialog in section


• 解析法: ある領域で解析
• 左画面で白線を動かして（隅の交点がハンドル）、解析する領域を設定する。
• Calculate -> Decay Matrix：　右にIntensity-modulated のLifetime画像がでる。

• 色が出ないとき：　Option -> Color -> Continuous -> Min, Maxの数字を変える。
• 一番右のグラフは、その分布；　μとSigmaは図中のプラスと白線。ピクセルごとの値なので、サンプルがないピクセルが多いと意味がない。
• ヒストグラムを強度ごとに転換する：　Options -> Preferences -> Histogram -> Pixel Intensity　
• Options>Prefrences: Show Intensity in Lifetime Window　設定領域以外ではintensityが見える。
• カラーレンジは、端の線をマニュアルで動かすか、または数字を入力する；Options -> Color -> Max, Mini　

• 解析法：　特定の細胞で解析
• Mask -> Define （あるいは左画面の緑のアイコン）から赤十字を出す。ドラッグして細胞を囲む
• Mask -> Undefine （あるいは左画面の緑と赤線のアイコン）で消去できる。

• 左の赤い錠のアイコンをおすと、その細胞のDecayが下のグラフにでる。

• χ²の値が最小になるように、T2の時間と、Componentの数を変化させる。 このTurquoiseの場合、Componentを二つにしても、3000以外の蛍光寿命は出てこない。しかし、T2の時間を短くすると二つになるので注意が必要。
• 詳細は、SPCImage manual 27 page参照
• 画面の切り替え：　Options -> Color -> Coding of tm [ps](平均蛍光寿命） ほかにもいろいろある。
• 画像の出力：
• Defaultでは画面をコピーするだけなので次の設定をOFFにすること。Options -> Intensity -> Other -> Interpolate pixels。 ただし、これをやると、画面の更新が遅くなるらしい。気になる場合は、Exportのつど、Interpolate OFFにする。
• ノートに貼る程度の写真なら、アクセサリー→Snipping Tool→画像を囲む →コピ→Excelにペースト。解析手法もはいるのでこの方がベター。
• File -> Export -> Color coded image, ON; with legend, ON; Format, TIF
• Legend をONにすると、MetaMorphで開けなくなる。この場合、Legendだけ別に出力する。
• File -> Export -> Matrix -> Color Coded Valueとすると、Calculateした領域のlifetimeのデータがAscフォーマットででてくる。 Excelで見るなら、スペースとコンマを区切り文字に指定すればよい。 しかし、画像化することを考えればMATLABに出力すべきでしょう。MetaMorphで解析する方法は次項参照。
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MetaMorphでの解析

SPCImage
• SPCImageで解析する領域を選択
• 上記のように条件検討ののち、Calculate -> Decay Matrix
• File -> Export -> Matrix; Color Coded Value, Pixel Intensities; Image, Color Coded Image, TIF; 。
Excel
• "**_color coded value.asc" というファイルを開いて、データサイズを確認。これが面倒なら、領域を指定せずにCalculateして、512x512とするという手もあるかも。

MetaMorph
• File -> Open Special ->　Import -> File Type, Text; Depth, 16; Width, Height 入力(Excelの列数と行数）
• **_color coded value.asc. Pixelごとのlifetimeなどを計算できる。
• **_photons.asc, intensity. PixelごとのPhoton Count (強度）。
• 後者でマスクを作って解析するといい。
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Trouble shooting

• DCC-100 does not start up. This may disturb synchronization. Check DCC-100 detector control.

• SYNCがでない：　光がDCC-100まで来ていない ---> 700 nmではsynchroしないみたいだ
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